Projekt „Dekódování molekulárních principů evoluce enzymů“

Strukturní biolog Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D. působící v Loschmidtových laboratořích Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity od roku 2017, se zabývá proteinovým inženýrstvím. Pro svůj projekt „Dekódování molekulárních principů evoluce enzymů“ získal podporu tři miliony korun na tři roky od Grantové agentury Masarykovy univerzity (GAMU) v kategorii H. V této kategorii GAMU podporuje rizikové projekty, které mají reálný potenciál posunout hranice svého oboru.

Martin Marek během přípravy vzorků v rámci krystalografického experimentu na kruhovém urychlovači částic (synchtrotronu) ve Villigenu (Švýcarsko).

Co je cílem projektu „Dekódování molekulárních principů evoluce enzymů“?

Enzymy jsou proteinové makromolekuly, které katalyzují většinu chemických reakcí probíhajících v živých organismech, a nové nepřirozené katalytické funkce mohou být do enzymů vloženy pomocí metod proteinového inženýrství. Enzymy jsou využívány jako vysoce specifické biokatalyzátory v řadě průmyslových a environmentálních technologiích a biomedicíně.  V rámci tohoto projektu chceme pochopit záhadu, jak ze společného molekulárního prapředka vznikly enzymy strukturně sice velmi podobné, ale schopné katalyzovat naprosto rozdílné chemické reakce.

Našim cílem je porozumět molekulárním principům, jak enzymy získávají svou strukturní diverzitu a konformační flexibilitu, která jim umožňuje se vyvíjet, adaptovat a získávat tak nové, často vysoce specifické biokatalytické funkce. Snažíme se tedy odhalit molekulární podstatu funkční diverzifikace a specializace enzymů. Získané poznatky mohou zásadně obohatit naše znalosti molekulární evoluce.

Věříme, že odhalením molekulárních detailů ve strukturách enzymů a objasněním postupných evolučních změn se nám podaří vytvořit nové teoretické koncepty, které by následně mohly být implementovány do pokročilých softwarových nástrojů pro vývoj nových biokatalyzátorů, které najdou uplatnění v různých oblastech biotechnologií či biomedicíny.

 

Projekt navazuje na předchozí úspěch spočívající v rekonstrukci enzymatického prapředka.  Můžete se o něm blíže zmínit?

 

V Loschmidtových laboratořích dlouhodobě studujeme enzymy z rodiny halogenalkandehalogenas. Tyto enzymy pochází převážně z mikroorganismů schopných využívat halogenované uhlovodíky, a aktivně se podílejí na jejich biodegradaci. Díky těmto unikátním vlastnostem jsou halogenalkandehalogenasy vyhledávány jako biokatalyzátory pro degradaci toxických sloučenin v kontaminovaných průmyslových oblastech.

Pozoruhodný je fakt, že halogenalkandehalogenasy vykazují vysokou sekvenční a strukturní podobnost s enzymem luciferasou z mořského korálu Renilla reniformis (RLuc). Tato podobnost ukazuje na jejich společnou evoluční historii. Zatímco halogenalkandehalogenasy patří mezi hydrolasy, které hydrolyticky štěpí halogenované uhlovodíky na příslušné alkoholy, luciferasa RLuc je funkčně nepříbuzná monooxygenasa, která katalyzuje oxidaci koelenterazinu za současné produkce světla (tzv. bioluminiscence). Otázkou tedy zůstává: jak je možné, že tak strukturně podobné enzymy vykonávají tak rozličné katalytické funkce?

Za tímto účelem jsme bioinformaticky předpověděli posledního společného prapředka (AncHLD-RLuc), který existoval před mnoha milióny let, tedy ještě předtím, než došlo k funkční specializaci dnešních enzymů. Gen kódující tohoto enzymatického prapředka byl laboratorně syntetizován a příslušný enzym vyprodukován v buňkách bakterie Escherichia coli. Velkým překvapením pak bylo, když biochemické analýzy ukázaly, že tento „oživený“ enzymatický prapředek vykazuje duální aktivitu – je schopen jak degradovat halogenované uhlovodíky, tak i oxidovat koelenterazin za současné produkce světla, byť s mnohem menší efektivitou než to dovedou dnešní moderní enzymy.              

V rámci projektu GAMU H chceme na molekulární úrovni objasnit evoluční kroky, které vedly k funkční specializaci moderních halogenalkandehalogenas a luciferasy RLuc. Právě rekonstrukce a studium společného prapředka je elegantní nástroj pro objasnění strukturních změn a dynamických vlastností, které vedly k funkční diverzifikaci a specializaci moderních enzymů. Tento vysoce rizikový projekt má potenciál posunout oblast racionálního enzymového inženýrství.

Zmražený krystal enzymu halogenalkandehalogenasy DhaA v nylonové smyčce, která byla umístěna do rentgenového paprsku za účelem sběru krystalografických dat. Žlutý rámeček ukazuje velikost paprsku a místo sběru dat.

Jak bude projekt probíhat?

K analýze struktur enzymatického prapředka a moderních enzymů použijeme metody molekulární a strukturní biologie. Zejména pak proteinovou krystalografii a pokročilé metody hmotnostní spektrometrie. Místně cílená mutageneze a počítačové simulace nám pomohou objasnit roli jednotlivých molekulárních elementů (aminokyselin) ve funkční diverzifikaci enzymů. Jedna metoda pro studium komplexních biologických reakcí nestačí.

Konvenční analýzy umožňovaly studovat enzymové struktury pouze v jejich statické podobě. My nyní se snažíme zavádět nové techniky, kde bude možné vidět proces enzymatické katalýzy v reálném čase, např. metoda časově-rozlišené nanokrystalografie nebo pokročilé in silico simulace. Chceme prozkoumat, jak se substrát navazuje na enzym, jak vypadá enzym-substrátový komplex, k jakým konformačním změnách dochází v průběhu katalýzy apod.

Máme stanoveny tři specifické cíle.

Prvním cílem je vyřešit atomární struktury enzymatického prapředka (ancHLD-RLuc) a prozkoumat molekulární detaily jeho funkční promiskuity.

Enzymy, které studujeme jsou mnohonásobně menší než například vysoce symetrické virové částice, tudíž prozatím není prakticky možné využít mikroskopické techniky pro studium jejich atomárních struktur. Proto používáme pro studium struktury enzymů rentgenovou krystalografii. Abychom mohli studovat strukturu enzymů pomocí rentgenové krystalografie, potřebujeme nejprve daný enzym vykrystalizovat, což mnohdy není triviální úkol. Představte si stejně velký krystal enzymu a diamant. Krystal enzymu bude mnohonásobně dražší. Krystal enzymu je ale křehký, protože obsahuje velké množství vody (40-60 %) a rozmáčkli byste ho jako malinu mezi prsty. Enzym je ve vodném prostředí neustále se pohybující biologická makromolekula čítající desetitisíce atomů.

Přestože krystalizovat enzymy není lehké a v minulosti to trvalo i několik měsíců, v naší laboratoři máme potřebné know-how i technické vybavení a dokážeme to během pár dnů. Pokud se enzym nedaří vykrystalizovat do 2-3 týdnů, tak změníme podmínky pro krystalizaci nebo enzymové makromolekuly modifikujeme (stabilizujeme) pomocí metod genového a proteinového inženýrství. Čím více je enzym pohyblivý, tím je krystalizace náročnější.

Chceme prostudovat molekulární struktury enzymu ancHLD-RLuc a jeho enzym-substrátových komplexů během katalýzy. Zvláštní pozornost budeme věnovat vývoji nových světlem řízených analogů substrátů, umožňujících časově rozlišenou nanokrystalografii. Na přípravě těchto substrátů spolupracujeme s týmem prof. Petra Klána z Ústavu chemie a RECETOX.  

Ve druhém kroku budeme zkoumat konformační dynamiku enzymu ancHLD-RLuc, tedy jeho pohyby během katalýzy.  K tomu mimo jiné použijeme metodu výměny deuteria za vodíkové protony. Vodík je běžnou součástí enzymu a deuterium je stabilní izotop vodíku, který nepodléhá radioaktivní přeměně. V přírodě se deuterium běžně vyskytuje namísto lehkého vodíku. V průměru připadá na jeden atom deuteria 6 000 atomů normálního vodíku. Ve spojení s kyslíkem tvoří deuterium tzv. těžkou vodu, D2O. Enzym vložíme do těžké vody, kde začne docházet k výměně deuteria za protony vodíku přítomné v molekulách enzymu.

 

Jeden z difrakčních obrazů enzymu halogenalkandehalogenasy DhaA. Bílý stín vedoucí do středu snímku na levé straně představuje lapač primárního svazku, který chrání detektor před poškozením.

Časově-rozlišená hmotnostní spektrometrie nám pomůže odhalit proteinové elementy, ve kterých se vyměnilo nejvíce deuteria v daném časovém okně, což může nepřímo ukazovat, že tyto proteinové části jsou nejvíce mobilní a tedy i funkčně (enzymaticky) důležité. Tato část výzkumu bude prováděna ve spolupráci s prof. Lenkou Hernychovou z Masarykova onkologického ústavu a bude doplněna pokročilými molekulárně-dynamickými simulacemi.

Třetí část projektu je zaměřena na experimentální validaci (ověření) mechanismu katalýzy a jeho evoluční původ. Můžeme např. pomocí metod genového inženýrství provádět jednobodové cílené mutace, kdy jednu aminokyselinu vyměníme za jinou. Nebo můžeme vyměňovat celé části proteinu a tzv. „roubovat“ celé molekulární elementy. Budeme zjišťovat, jak tyto změny ovlivňují funkci enzymu. Pomocí uvedených technik zjistíme, které strukturní elementy byly důležité pro funkční specializaci halogenalkandehalogenas a luciferasy. Pomocí sériové mutageneze můžeme do enzymatického prapředka ancHLD-RLuc začleňovat elementy, které se ukázaly v našich experimentech jako klíčové pro evoluci katalytických funkcí, a můžeme tak experimentálně rekonstruovat celou evoluční cestu v laboratoři.

 

 Strukturní model enzymu halogenalkandehalogenasy DhaA. Barevné tečkované dráhy zobrazují molekulární tunely vedoucí do aktivního místa enzymu, kde dochází k chemické přeměně substrátu. Fialové koule představují atomy kryptonu, který byl použit pro experimentální mapování molekulárních tunelů.

Jak daleko jste ve výzkumu v tomto konkrétním projektu?

Naše předběžné výsledky naznačují, že doposud málo prostudované a přehlížené proteinové elementy, zejména tzv. smyčky, hrají klíčovou roli ve funkční diverzifikaci a specializaci studovaných enzymů. Smyčky umožňují enzymům efektivně prozkoumávat konformační prostor, navázat substrát, transportovat ho do aktivního místa a následně provést produktivní biokatalýzu. Aminokyselinové složení a fyzikálně-chemické vlastnosti smyček jsou velice důležité pro schopnost enzymu katalyzovat chemickou reakci.

Podařilo se nám pomocí metod strukturní biologie a proteinové biochemie experimentálně prokázat, že modifikací těchto flexibilních smyček, dokážeme výrazně ovlivňovat katalytické funkce enzymů či případně získat úplně novou enzymatickou aktivitu.

Co Vám usnadní finanční pomoc od Grantové agentury Masarykovy univerzity?

Finanční podpora z GAMU H nám umožní získat nové výsledky a data, díky kterým zvýšíme naši konkurenceschopnost pro podávání mezinárodních grantových aplikací, například do European Research Council (ERC).

Konkrétně nám pomoc z GAMU pomůže spolufinancovat laboratorní výzkum, pořídit menší laboratorní přístroje a vybavení. Budeme moci pravidelně navštěvovat zahraniční synchrotronová zařízení, abychom mohli sbírat krystalografická data.

Díky úspěchu v tomto projektu se můžeme účastnit světových konferencí, workshopů a kurzů. Mně osobně tato podpora umožní si osvojit metody projektového a personálního managementu pro efektivnější řízení týmu spolupracovníků a výzkumných projektů.

Jaký je prozatím Váš největší osobní vědecký úspěch?

Během předchozích zahraničních stáží se mi podařilo vyřešit trojrozměrné atomární struktury několika epigenetických regulátorů (např. histon-chaperonových makromolekulárních komplexů) a dále několika enzymů z rodiny histonových deacetylas, jejichž abnormální exprese (produkce) je často zodpovědná za různé patologické procesy v lidském těle včetně nádorového bujení. Rovněž se nám podařilo prokázat, že histonové deacetylasy jsou relevantní terapeutické cíle pro léčbu infekčních parasitických onemocnění.

Díky znalosti trojrozměrné struktury v kombinaci s virtuálním prohledáváním knihoven chemických sloučenin a počítačovým modelováním se nám podařilo navrhnout specifické nízkomolekulární sloučeniny (inhibitory). Tyto inhibitory byly úspěšně syntetizovány a ukázalo se, že velice efektivně a selektivně blokují funkci studovaných enzymů a potlačují růst rakovinných buněk či zabíjejí eukaryotické parasity, aniž by vykazovaly vedlejší efekty. V současné době slouží tyto molekuly jako prototypy epigenetických léčiv budoucí generace pro léčbu nádorových onemocnění, neurodegenerativních poruch či parazitických infekcí.

Jaký je váš osobní vědecký cíl?

Chtěl bych přispět k pochopení principů molekulární evoluce proteinů a tyto poznatky posléze využít k vývoji nových biokatalyzátorů, které najdou praktické uplatnění při řešení problémů naší civilizace zejména v oblasti environmentálních technologií, znečištění životního prostředí nebo syntézy nových materiálů pro průmyslové či biomedicínské aplikace.

Máte za sebou několik působení v zahraničí. Co vám tyto zkušenosti daly?

Nová prostředí a setkání s lidmi vždy člověka obohatí. Získal jsem také zkušenosti s přístrojovým vybavením a  novými metodami, které u nás dosud nejsou možné.  První postdoktorandská stáž byla v Nizozemí, druhá ve Francii.

Profesní kontakty mi nyní usnadňují získaní měřících časů na výše zmíněných synchrotronových zařízeních, nebo přístup k nejpokročilejším strukturním analýzám jako jsou např. časově-rozlišená nanokrystalografie či vysokotlaká proteinová krystalografie, umožňující studium molekulárních enzymových tunelů. Dlouholeté zahraniční zkušenosti mi nyní pomáhají nacházet způsoby, jak krystalizovat a strukturně analyzovat velmi dynamické biologické makromolekuly.

Co by podle vás měl dobrý vědec mít?

Měl by mít entusiasmus, optimismus, vnitřní motivaci a touhu po poznání. Musí být také trpělivý, protože pokusy jsou časově náročné a ne každý experiment vyjde tak, jak si člověk přeje. Důležitou vlastností vědce je všímavost a smysl pro detail. Vědec je vlastně detektiv, který musí pracovat vysoce systematicky a nesmí být zbrklý. Svoje výsledky, ale i teze a teorie by měl být schopen formulovat jednoduše, aby je pochopil i laik.

 

MVDr. Bc. Petra Malátková , Odbor výzkumu RMU